SDx系膜系統

固定膜結構

固定膜是以親水性的聚乙二醇PEG)鏈通過有機二硫化物固定劑以共價鍵結合到金電極表面的保持平坦的支撐磷脂雙分子層。親脂烷烴植烷基團鍵合到聚乙二醇鏈的頂部充當支架圍繞該膜脂質自發聚集,最終形成連續膜。

二硫化物固定劑,PEG鏈,和植烷基團組成一個分子束,因為它將膜束縛在了金表面。事實上,這些分子束在金基片上以相似分子的形式彼此分離的,稱為spacer,因為它們缺乏親脂的植烷基團。這些spacer在固定膜下,並且與膜沒有任何的直接接觸。分子束和spacer完全覆蓋金表面,但它們不是緊密堆積的,因為它們是由大量的有機二硫化物固定基團分隔的。

1 元件的系膜系統

分子束和spacer之間的平均距離約含9個水分子,而金表面上方膜的的高度為約4 nm(但0.5 nm是被有機二硫化物固定劑佔用)。

因而膜與金表面之間的空間是PEG鏈,二硫化物固定劑固基團,水分子,各種陽離子和陰離子,以及小的水溶性分子的混合物,被統稱為tethaPlasm™。它類似於一個活細胞的細胞質。一個恒定的偏置電壓可以給含有過量陽離子或陰離子的tethaPlasm''充電,在tethaPatchtehaPod實驗(見下文)之前。

固定膜很難!

分子束對spacer的比例是可以在製造過程中改變的。標準tethaPlate™通常採用1:10的比例,這是兼顧細胞膜的穩定性和靈活性的最佳比例。如果需要更大的靈活性,小至1:100的比例也可以用,但不推薦低於這個比例,因為膜的完整性會變得不可靠。相反,如果需要特殊的穩定性,可使用高達100%的比例。

用標準10%製備的固定膜非常強健,具有幾個月的典型壽命(如果實驗之間儲存在4的話)。它們還非常耐電脈衝,並且適用範圍在-500+800 mV,這遠遠大於可在傳統的全細胞電壓鉗位元實驗中施加的電位。

The tethaPlate

tethaPlate包括六個各有一個金電極的腔室(表面積2.1 mm23.0×0.7 mm),金電極上已預先塗有分子束和間隔分子。另外自發形成膜只需要一個合適的磷脂混合物。另一個無塗層的金電極立在0.15毫米膜上面,但不與膜進行相互作用。

tethaPlate已被證明是一個盛放固定膜製劑非常堅固的外殼,保存在4時可穩定幾個月,而許多離子通道的準備工作將持續數天,幾個星期(或更多)!

在培訓視頻上看看如何組裝一個tethaPlate並製作固定膜。

膜蛋白

許多蛋白質包括親脂性和親水性部分,這些影響蛋白質的三級結構。親脂部分通常是與細胞或細胞器,膜相關聯的,因此蛋白質被稱為膜蛋白。

有一類特殊的膜蛋白是促進陽離子或陰離子穿過不透水親脂性細胞膜。這種蛋白質被稱為離子通道。

2 離子通道蛋白在固定膜上顯示的規模。
注意蛋白質的方向,使其上層結構封裝在tethaPlasm外面。

固定膜的分子束/間隔比決定了可容納的蛋白質的最大尺寸。人們發現標準1:10的比例適於宿主的蛋白質結構高達40000 Da(即實際在膜當中的蛋白的部分),然後將這些單獨的蛋白可以組裝進入低聚體的孔隙結構 - 這通常是固定膜中離子通道的最終形式。

注意,即使是小的離子通道多肽,如短桿菌肽(1882 Da)和纈氨黴素(1111 Da),也同樣可以容納在固定膜中。

較大的離子通道,如在圖2中所示,經常有上層結構延伸到鄰近於所述膜的水溶液中。即使擁擠的tethaPlasm也不能不能容納一個中等大小的上層建築,迫使膜蛋白採取一種較優的方向(像經常發生在一個活細胞內的情況一樣)。

離子通道

低分子量多肽離子載體和離子通道(如短桿菌肽、黴素、爪蟾抗菌肽、丙甲菌素和離子黴素)有市售的純物質。較大的蛋白可以由市售的洗滌劑或脂質基質提供。然而,大多數較大的蛋白必須利用基因組技術使用特定的細菌培養製成,無論是由自己還是由合作的生物技術公司獲得。

通常情況下,培養細菌要有相應的基因或RNA片段人為地植入,使它們表達所需的離子通道蛋白。通過幾天的培養後可以獲得細菌,對蛋白質組分分離和純化(通常通過凝膠電泳)。

而這是在 1990 年時最先進的技術,現在這些技術得到了很好的發展並在蛋白質組學實驗室廣泛使用。

人類基因組本身被認為為大約400個不同類型的離子通道代碼,且只有一小部分被詳細研究。然而,只有少數離子——鈉、鉀、鈣、鎂、氫、氯(和其他陰離子)——相關離子通道的研究。不同組織不同類型的活動需要多種離子通道。例如不同的鉀離子通道可以參與神經細胞的動作電位傳播,心率的調節,細胞對壓力變化的回應(機械敏感性離子通道)。

不同的生物體有類似的離子通道, 但是根據物種要求不同結構往往稍微改變以優化功能。

離子載體

天然的(如離子黴素和calicimycin),以及人工的(如冠醚,calixeranes和穴狀配體)離子載體也可以用系膜系統研究。離子載體並不總是多肽,也可能是相當小的分子,但是它們必須是至少部分親脂性,以確保它們能夠進入膜。

經典的膜片鉗

經典的膜片鉗實驗中使用一個微量電極,其定位對細胞膜只覆蓋一個,或是幾個離子通道。通常電極要獲得合適的位置,需要長期的反復實驗過程。離子電流信號通常非常小(幾皮安),必須非常小心的操作以實現良好的信號/雜訊水準。

 3 一個經典的膜片鉗實驗(http://en.wikipedia.org/wiki/Patch_clamp

該技術的變體包括全細胞和卵母細胞的膜片鉗,其中許多離子通道的信號可以同時記錄。這提供了更大的(和更安靜的)信號,但可能會比較複雜,因為可能存在幾種類型的離子通道併發信號的情況。

近年來全自動膜片鉗已進入市場,但是由於為了獲得可再現的信號,定位微量電極困難,該技術仍然受到阻礙。

基因組學和蛋白質組學革命

正如上面提到的,21世紀的最初幾年,我們看到基因組學和蛋白質組學技術快速發展,現在可以隔離大量的單一類型的離子通道蛋白。這種技術現在在大學、研究機構、製藥企業實驗室和醫院研究部門廣泛應用。

首次,在常規的基礎上用適量的純蛋白提供單一類型的離子通道的研究可以完成。研究人員不再局限于為檢測一個或幾個離子通道做補充。

The tethaPatch

在人工固定膜的一個大膜片 (面積2.1平方毫米)裡組裝一個單一類型的離子通道蛋白,介於11000萬個通道可以並行進行研究。測量的離子電流是來自在膜片上所有離子通道的總和,所以可以獲得微安範圍信號和同時得到低雜訊水準。因為離子通道自發地將自己容納到工作電極鍵合的膜上,不同於微量電極的方法。

tethaPatch技術,類似于全細胞膜片鉗,通常在幾分鐘內提供結果,否則與常規技術則需要數小時。也因為固定膜非常強勁,可以應用電壓脈衝,否則會打擊傳統的密封膜片箝製備。因而,與先前可實現的脈衝振幅(通常小於±300毫伏以下)相比,電壓門控,以及機械敏感性離子通道,現在可以在更寬範圍的脈衝振幅(-500800毫伏之間的電位可以應用)下研究,從而導致新的離子通道行為的機制的解成。

ER466 集成穩壓器適合與tethaPatch一起使用,用於脈衝產生和電流信號的資料獲取。

The tethaPod

tethaPod 技術利用系膜系統提供的相對較大的信號。通過給tethaPlate™電極施加一個小振幅(20 mV) 頻率變化的交流信號,膜電導率和電容可以直接測定。這特別適用於製藥研究,將不同濃度的離子通道阻斷劑或激勵劑加到tethaPlate™可以連續監測膜電導。採用劑量/回應方法分析結果,可快速篩選潛在的候選藥物。

 

引文

Comparative Study of the Bacterial Sodium Channel NaChBac Function using Patch Clamp and A.C. Impedance Spectroscopy in a Tethered Membrane.
Bruce A. Cornell, Gwenael Scolan, Andrew M. Powl, Sonia Carne, Bonnie A. Wallace, Biophysical Journal, 102, 3, 338a, 2012. DOI: 10.1016/j.bpj.2011.11.1852

The protective effect of osmoprotectant TMAO on bacterial mechanosensitive channels of small conductance MscS/MscK under high hydrostatic pressure. 
Evgeny Petrov, Paul R. Rohde, Bruce Cornell, and Boris Martinac. Channels, 6:4, 1-10, 2012. DOI: 10.4161/chan.20833

Ion Channel Proteins that Spontaneously Insert into Lipid Bilayer Membranes: An Impedance Spectroscopy Study Employing Tethered Membranes.
Bruce A. Cornell, Heba Alkhamici, Louise Brown, Sonia Carne, Sophia C. Goodchild, Russell Richards, and Stella M. Valenzuela. Biophysical Journal, 102, 682a-683a, 2012. DOI: 10.1016/j.bpj.2011.11.3710

A High-Throughput Technique for Screening Novel Antibacterial Agents Targeting Bacterial Mechanosensitive Channels.
Bruce A. Cornell, Andrew R. Battle, Sonia Carne, and Boris Martinac. Biophysical Journal, 102,122a,  
DOI: 10.1016/j.bpj.2011.11.683

Making lipid membranes even tougher.
Jognandan Prashar, Phillip Sharp, Mathew Scarffe, and Bruce Cornell. Journal of Materials Research, 22, 2189-2194, 2007. DOI: 10.1557/jmr.2007.0288

Tethered Bilayer Membranes Containing Ionic Reservoirs: Selectivity and Conductance.
Gowri Krishna, Jurgen Schulte, Bruce A. Cornell, Ron J. Pace, and Peter D. Osman. Langmuir, 19, 2294–2305, 2003.
DOI: 10.1021/la026238d

Tethered Bilayer Membranes Containing Ionic Reservoirs: The Interfacial Capacitance.
Gowri Krishna, Jurgen Schulte, Bruce A. Cornell, Ron Pace, Lech Wieczorek, and Peter D. Osman. Langmuir, 17, 4858–4866, 2001. DOI: 10.1021/la001480a

Tethered-bilayer lipid membranes as a support for membrane-active peptides.
B. A. Cornell, G. Krishna, P. D. Osman, R. D. Pace and L. Wieczorek. Biochemical Society Transactions, 29, 613–617,  2001. DOI: 10.1042/bst0290613

Tethered Lipid Bilayer Membranes: Formation and Ionic Reservoir Characterization.
Burkhard Raguse, Vijoleta Braach-Maksvytis, Bruce A. Cornell, Lionel G. King, Peter D. J. Osman, Ron J. Pace, and Lech Wieczorek. Langmuir, 1998, 14, 648–659 1998. DOI: 10.1021/la9711239